藥物抗體比 (DAR)和藥物載量或 DAR 分布是 ADC 的兩個(gè)主要關(guān)鍵特性。 DAR值定義為與抗體綴合的藥物分子的平均數(shù)量。相反，藥物負(fù)載或 DAR 分布定義為抗體載體上存在的綴合藥物數(shù)量的化學(xué)計(jì)量分布。 DAR 值決定了 ADC 的功效和安全性。高 DAR 可能會(huì)阻礙 ADC 的藥代動(dòng)力學(xué)特性，而低 DAR 會(huì)顯著限制這些療法的效力。理想情況下，DAR 分布值應(yīng)在 2-4 之間。

已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種方法來(lái)以越來(lái)越高的精度測(cè)量這些特性。然而，這些系統(tǒng)固有的異質(zhì)性以及抗體載體中復(fù)雜的翻譯后修飾的存在使得這種表征在分析上具有挑戰(zhàn)性。

目前，這些屬性是使用以下方法測(cè)量的：

• 藥物與抗體的比率（平均DAR）：

• 紫外可見(jiàn) (UV/Vis) 光譜

• 組織蛋白酶-B酶切法

• 載藥量分布：

• 毛細(xì)管電泳（CE）

• 關(guān)鍵屬性：

• 疏水相互作用色譜 (HIC)

• 反相高效液相色譜（RP-HPLC）

• 質(zhì)譜（MS）

用于 DAR 測(cè)定的紫外-可見(jiàn) (UV/VIS) 光譜

紫外/可見(jiàn)光譜是用于 ADC 表征的方法。該方法傳統(tǒng)上用于確定蛋白質(zhì)濃度，它依賴(lài)于測(cè)量不同波長(zhǎng) (λ) 下的吸光度。該方法的先決條件是：（i）有效負(fù)載必須具有紫外/可見(jiàn)發(fā)色團(tuán)； (ii) 抗體和有效負(fù)載應(yīng)具有特點(diǎn)的最大吸光度波長(zhǎng)（λ最大值，前者通常為 280 nm）； (iii) 藥物不得干擾抗體的吸收光譜，反之亦然。

如果 ADC 符合所有先決條件，則可以根據(jù)吸光度值和消光系數(shù)計(jì)算兩種組分的濃度。隨后，平均 DAR 可以簡(jiǎn)單地通過(guò)將平均藥物濃度除以平均抗體濃度來(lái)估計(jì)。

盡管這種方法通常用于估計(jì) ADC 的 DAR，但它存在重要的局限性。例如，ADC 樣品中游離藥物的存在可能導(dǎo)致 DAR 值的高估。此外，紫外/可見(jiàn)光譜不提供任何有關(guān)藥物負(fù)載分布的信息，而藥物負(fù)載分布是一個(gè)同樣重要的特性。因此，該方法保留用于常規(guī)質(zhì)量控制操作，并且在新 ADC 的早期開(kāi)發(fā)過(guò)程中很少使用。

用于 DAR 測(cè)定的組織蛋白酶 B 酶切法

組織蛋白酶 B 是一種溶酶體酶，負(fù)責(zé)用肽接頭切割 ADC 構(gòu)建體。最近開(kāi)發(fā)了基于組織蛋白酶 B 的 DAR 測(cè)定酶法。該方法涉及使用多種酶和還原劑進(jìn)行一系列處理，以允許結(jié)合藥物的釋放。隨后通過(guò)色譜分離對(duì)處理后的游離藥物進(jìn)行定量。

ADC 首先用IdeS 蛋白酶預(yù)處理，產(chǎn)生 F(ab')2 和 Fc 片段，然后用2-巰基乙胺(2-MEA) 還原，以進(jìn)一步裂解為 Fd?、Fc 和 Lc。這種復(fù)雜的預(yù)處理可確保更好地進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)并更有效地切割有效負(fù)載。在這些步驟之后，用組織蛋白酶 B進(jìn)行消化，然后通過(guò) RP-HPLC-UV 進(jìn)行蛋白質(zhì)組分的分離。

由于兩種組分在藥物定量之前被分離，因此該方法克服了 UV/Vis 方法所施加的最常見(jiàn)限制 -藥物和抗體組分需要不同的 λ 最大值。此外，這種方法也被認(rèn)為比質(zhì)譜法更精確，質(zhì)譜法的質(zhì)量信號(hào)通常會(huì)受到疏水性和凈蛋白質(zhì)電荷的影響，而疏水相互作用色譜 (HIC)在分析隨機(jī)綴合的 ADC 時(shí)可能會(huì)受到分辨率效率低的影響。

基于組織蛋白酶 B 的方法最重要的限制是無(wú)法辨別藥物負(fù)載分布。此外，由于該方法的復(fù)雜性，其用于質(zhì)量控制目的的實(shí)施仍然具有挑戰(zhàn)性。因此，該方法在早期開(kāi)發(fā)或抗體研究環(huán)境中仍然更有用。

用于藥物載量分布測(cè)定的毛細(xì)管電泳 (CE)

毛細(xì)管電泳（CE）具有儀器簡(jiǎn)單、規(guī)格小型化、分離高效快速、進(jìn)樣量少、分辨率高等特點(diǎn)。已經(jīng)測(cè)試并實(shí)施了不同的 CE 方法來(lái)表征 ADC，包括毛細(xì)管凝膠電泳 (CE-SDS)、毛細(xì)管等電聚焦 (cIEF)、成像 cIEF (iCIEF)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳 (CZE) 和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法 ( CE-MS）。所有這些方法都為 ADC 提供了不同級(jí)別的表征，例如異構(gòu)體、乙二醇分析和翻譯后修飾等。

與基于組織蛋白酶 B 的方法一樣，CE 方法也是最近才開(kāi)發(fā)出來(lái)的。因此，很少有文獻(xiàn)可以支持他們。然而，在這些方法中，iCIEF 始終取得了有希望的結(jié)果。該技術(shù)允許根據(jù) ADC 電荷變體的等電點(diǎn) (pI) 對(duì)其進(jìn)行分離。通過(guò)這種方式，可以有效分離未結(jié)合的抗體和具有不同載藥量的不同 ADC 種類(lèi)，有助于監(jiān)測(cè)批次間的一致性、載藥量分布和未結(jié)合的抗體。其缺點(diǎn)是該技術(shù)僅在基于賴(lài)氨酸的綴合 ADC 上進(jìn)行了測(cè)試。因此，目前尚不清楚它是否可以應(yīng)用于其他共軛化學(xué)。

用于詳細(xì) DAR 分析的疏水相互作用色譜 (HIC)

疏水相互作用色譜 (HIC) 的工作原理是在疏水固定相上運(yùn)行反鹽梯度。固定相根據(jù)樣品成分的疏水性保留和分離樣品成分，并且由于該方法使用溫和的條件，因此在分析過(guò)程中保留了復(fù)雜蛋白質(zhì)種類(lèi)的天然構(gòu)象。因此，HIC 方法可用于測(cè)量平均 DAR并確定ADC 中的藥物負(fù)載分布。

在分析非共價(jià)蛋白綴合物（例如半胱氨酸連接的 ADC）時(shí)，溫和條件的使用使得該技術(shù)極其方便。這些綴合物通常在 RPLC（反相液相色譜）等更嚴(yán)格的色譜方法中解離，使得 HIC 成為這些生物藥物詳細(xì) DAR 分析的參考技術(shù)。

HIC 技術(shù)在分析基于賴(lài)氨酸和位點(diǎn)特異性的綴合 ADC 時(shí)效率相當(dāng)?shù)?。此外，該技術(shù)分離未結(jié)合分子的能力仍然有限，因?yàn)檫@些物質(zhì)僅被部分解析。然而，由于最近開(kāi)發(fā)了新的色譜柱和分離方案，HIC 仍然是半胱氨酸連接 ADC藥物載量分布分析的黃金標(biāo)準(zhǔn)。

用于詳細(xì) DAR 分析的反相高效液相色譜 (RP-HPLC)

反相高效液相色譜 (RP-HPLC) 廣泛用于表征藥物蛋白質(zhì)。與基于 HIC 的表征相比，RP-HPLC 的優(yōu)點(diǎn)是由于流動(dòng)相的揮發(fā)性，該方法與質(zhì)譜法的兼容性。相比之下，HIC 使用與 MS 研究不相容的鹽梯度。 RP-HPLC 或簡(jiǎn)稱(chēng) RPLC（反相液相色譜）作為分析平均 DAR、載藥量分布、未綴合抗體和游離藥物接頭種類(lèi)的方法有著成功的記錄。

對(duì)于半胱氨酸連接的 ADC，RPLC 是 HIC 的最合適替代品，可用于詳細(xì)的 DAR 分析。然而，該方法的主要缺點(diǎn)之一源自已知會(huì)破壞半胱氨酸連接的 ADC 天然構(gòu)象的惡劣分析條件，通常導(dǎo)致輕鏈和重鏈解離。為了克服這一限制，ADC 通常在分析前用還原劑進(jìn)行預(yù)處理。在這種情況下，輕鏈和重鏈更容易分離和單獨(dú)評(píng)估?；蛘撸珹DC 也可以用 IdeS 進(jìn)行預(yù)處理并進(jìn)行化學(xué)還原以生成 Fc、LC 和 Fd 片段。

無(wú)論 RPLC 中 ADC 分析所用的方案如何，尋找合適的色譜條件仍然具有挑戰(zhàn)性。對(duì)于賴(lài)氨酸連接的 ADC，RPLC 分離提供的分辨率通常不足以區(qū)分具有不同載藥量的完整 DAR 種類(lèi)。因此，該方法對(duì)于平均 DAR 測(cè)定有效，但在分析賴(lài)氨酸連接 ADC 中的藥物負(fù)載分布時(shí)具有挑戰(zhàn)性。相比之下，位點(diǎn)特異性綴合 ADC 可以通過(guò) HPLC 或基于 HIC 的方法輕松分析。

一般來(lái)說(shuō)，獨(dú)立于綴合化學(xué)（半胱氨酸、賴(lài)氨酸或位點(diǎn)特異性），RPLC 可以作為平均 DAR 質(zhì)量控制的可靠方法，并且對(duì)于檢測(cè)雜質(zhì)的存在非常有用。此外，RPLC 方法可用于估計(jì) ADC 穩(wěn)定性并量化游離藥物分子，使其可用于新型 ADC 的廣泛早期表征及其生產(chǎn)工藝的優(yōu)化。

用于詳細(xì) DAR 分析的質(zhì)譜 (MS)

質(zhì)譜 (MS) 分析取決于分析物的電離效率，并包含多種強(qiáng)大的高分辨率技術(shù)。目前用于分析大生物分子的 MS 光譜儀使用電噴霧電離 (ESI)結(jié)合飛行時(shí)間 (TOF)或Orbitrap，這有助于不同 ADC 物種在還原或非還原條件下獲得高分辨率。

由于這些方法的敏感性，通常建議用 PNGase F 預(yù)處理 ADC，以消除 N-聚糖引起的異質(zhì)性，N-聚糖通常會(huì)掩蓋或干擾 MS 分析。流行的替代方案包括將 ADC 還原為重鏈和輕鏈、抗體載體的酶促片段化或兩者的組合。此外，對(duì)于通常電離效率特別低的賴(lài)氨酸連接的 ADC，研究人員已成功去除有效負(fù)載的疏水部分，成功提高了檢測(cè)靈敏度。

預(yù)處理通常可以對(duì) ADC 進(jìn)行更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)分析，包括以高精度和靈敏度檢測(cè)低豐度 ADC 物種。

結(jié)束語(yǔ)

本文涵蓋的所有不同方法都應(yīng)被視為互補(bǔ)的。事實(shí)上，使用不同方法獲得的結(jié)果的比較有助于在平均 DAR、藥物負(fù)載分布、未綴合抗體含量和游離有效負(fù)載連接體含量方面獲得更準(zhǔn)確的 ADC 分子指紋。此外，大多數(shù)這些技術(shù)的性能和準(zhǔn)確性在很大程度上取決于共軛化學(xué)。因此，在早期開(kāi)發(fā)過(guò)程中應(yīng)使用多種方法來(lái)確保這些生物藥物的正確和廣泛的表征。

盡管基于質(zhì)譜的方法在分辨率方面仍然是好的，但將其用于常規(guī)質(zhì)量控制通常并不可行。因此，通常應(yīng)選 HIC 或 CE 等替代方法來(lái)加快 ADC 生產(chǎn)和質(zhì)量控制。