差異培養(yǎng)基是含有能夠在視覺(jué)上區(qū)分生長(zhǎng)在其上的微生物的化合物的培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基利用微生物的代謝和生化能力，導(dǎo)致外觀發(fā)生明顯變化。

差異化培養(yǎng)基通常包含指示劑，例如染料、pH 指示劑或可以被某些微生物代謝但不能被其他微生物代謝的特定底物。這些指示劑的存在或不存在或由此產(chǎn)生的顏色變化有助于辨別不同的微生物群或識(shí)別特定的代謝活動(dòng)。

例如，使用含有 X-gal 的差異培養(yǎng)基進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，通過(guò)鑒定具有所需遺傳構(gòu)建體的菌落來(lái)促進(jìn)基因克隆。

選擇性培養(yǎng)基和差異培養(yǎng)基之間的差異與每種培養(yǎng)基如何用于篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞有關(guān)。選擇性培養(yǎng)基根據(jù)生長(zhǎng)情況篩選細(xì)胞，而差異培養(yǎng)基根據(jù)外觀篩選細(xì)胞。

選擇性培養(yǎng)基和差異培養(yǎng)基都可以幫助您決定在克隆過(guò)程中繼續(xù)使用哪些菌落。

使用選擇性培養(yǎng)基，不需要的細(xì)胞無(wú)法存活。因此，選擇是基于增長(zhǎng)的。

介導(dǎo)所需細(xì)胞和不需要細(xì)胞之間的分化的典型化合物是抗生素。

所需的細(xì)胞對(duì)這種抗生素具有抗性，即使在該抗生素存在的情況下也能生長(zhǎng)。然而，不需要的細(xì)胞對(duì)抗生素敏感并且無(wú)法存活。

使用差異培養(yǎng)基，所需的和不需要的細(xì)胞都會(huì)生長(zhǎng)，但可以根據(jù)集落的視覺(jué)特征來(lái)區(qū)分和篩選它們。

圖 1.選擇性媒體的工作原理與差異媒體的工作原理的圖示。只有幸存的菌落才能在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。使用差異培養(yǎng)基，所有菌落都會(huì)生長(zhǎng)，但可以被識(shí)別。

差異培養(yǎng)基的工作原理是它們含有特定酶的底物。

底物一旦被這種酶分解，就會(huì)產(chǎn)生有色產(chǎn)物。肉眼很容易發(fā)現(xiàn)顏色差異。

圖一的差異培養(yǎng)基示例顯示了結(jié)果中的這種顏色差異，其中白色菌落是所需菌落，而藍(lán)色菌落不是。

為了更深入地了解這一點(diǎn)，請(qǐng)查看圖 2，它演示了其工作原理。

您添加某種化合物（白色），我們在固體培養(yǎng)基板中將其稱(chēng)為化合物 C。當(dāng)化合物 C 被特定的酶（我們稱(chēng)之為酶 E）分解時(shí)，產(chǎn)物是藍(lán)色化合物。

圖 2.差分媒體工作原理的概念表示。

現(xiàn)在，在這個(gè)特定的示例中，您設(shè)計(jì)的基因構(gòu)建體使得具有所需基因構(gòu)建體的細(xì)胞將產(chǎn)生酶 E。因此，一旦它們?cè)谄桨迳仙L(zhǎng)，它們的集落就會(huì)呈藍(lán)色。

另一方面，不需要的菌落——沒(méi)有所需基因構(gòu)建的菌落不會(huì)產(chǎn)生酶 E，并且它們的菌落將是白色的。

圖 3.帶有藍(lán)色和白色菌落的平板照片。

在大多數(shù)克隆實(shí)驗(yàn)中，具有所需基因構(gòu)建體的菌落是白色的，不需要的菌落是藍(lán)色的。

這是通過(guò)稱(chēng)為 α 互補(bǔ)（α-complementation）的概念來(lái)實(shí)現(xiàn)的——大多數(shù)克隆宿主菌株（例如DH5-α）的一個(gè)特征。

由于本文是為了說(shuō)明差異培養(yǎng)基在基因克隆過(guò)程中如何發(fā)揮作用，因此我們不會(huì)過(guò)多討論藍(lán)白斑篩選背后的分子遺傳學(xué)。

為此，我們建議您查看這篇文章，其中我們?cè)敿?xì)說(shuō)明了藍(lán)白斑篩選的概念。

同樣，藍(lán)白斑篩選相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方案請(qǐng)參考這篇文檔。

然而，為了正確理解差異媒體的概念，這里簡(jiǎn)要描述了藍(lán)白斑篩選過(guò)程中發(fā)生的情況。

β-半乳糖苷酶是藍(lán)白斑篩選的核心。 β-半乳糖苷酶由lacZ基因作為lac操縱子的一部分合成，β-半乳糖苷酶分解乳糖。

DH5-α 等克隆宿主菌株編碼 β-半乳糖苷酶的突變形式，其中氨基末端的氨基酸 11-41 被刪除。這種突變型 β-半乳糖苷酶被稱(chēng)為ω-肽，它不能單獨(dú)分解乳糖或全功能 β-半乳糖苷酶（例如 X-gal）的其他底物。

同時(shí)，相應(yīng)的克隆載體如pUC19在多克隆位點(diǎn)編碼一種稱(chēng)為L(zhǎng)acZ-α或α-肽的多肽。 LacZ-α / α-肽組成 β-半乳糖苷酶的 59 個(gè)氨基酸。

當(dāng)宿主菌株的基因組表達(dá)ω-肽并且載體表達(dá)α-肽時(shí)，形成功能齊全的β-半乳糖苷酶，可以分解乳糖或其類(lèi)似物。這稱(chēng)為α-互補(bǔ)。

圖 4. α-互補(bǔ)示意圖。

因此，當(dāng)帶有克隆載體的宿主細(xì)胞接種在含有 X-gal 的培養(yǎng)基上時(shí)，表現(xiàn)出 α-互補(bǔ)的集落會(huì)產(chǎn)生功能性 β-半乳糖苷酶，分解 X-gal，形成藍(lán)色產(chǎn)物。結(jié)果，菌落呈藍(lán)色。

圖 5.功能性 β-半乳糖苷酶在含有 X-gal 的培養(yǎng)基中形成藍(lán)色菌落，用于藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)。

另一方面，不具有克隆載體表達(dá)的α-肽的宿主細(xì)胞不會(huì)表現(xiàn)出α-互補(bǔ)，并且不會(huì)產(chǎn)生功能性β-半乳糖苷酶。因此，X-gal不會(huì)被這些細(xì)胞分解。他們的殖民地將是白色的。

請(qǐng)注意，α-肽的基因位于克隆載體的多克隆位點(diǎn) (MCS)。因此，如果載體為空白，即 MCS 內(nèi)沒(méi)有克隆轉(zhuǎn)基因，則仍會(huì)產(chǎn)生 α 肽。在此，將發(fā)生 α-互補(bǔ)，并且由于 X-gal 被功能性 β-半乳糖苷酶分解，集落呈藍(lán)色。

如果載體在其 MCS 內(nèi)克隆了轉(zhuǎn)基因，則轉(zhuǎn)基因會(huì)破壞 α 肽的基因。該基因被破壞的結(jié)果是沒(méi)有產(chǎn)生功能性的β-半乳糖苷酶，并且X-gal不會(huì)被這些細(xì)胞分解。

圖 6.由于基因插入而破壞的lacZα序列不編碼 α 肽。

這就是為什么平板上 所需的菌落會(huì)是白色的——編碼 α 肽的基因被目標(biāo)轉(zhuǎn)基因破壞，這正是我們想要的。

因此，在這種情況下，只需查看集落，您就可以輕松辨別哪些細(xì)胞具有空白質(zhì)粒（它們是藍(lán)色的），哪些集落具有轉(zhuǎn)基因插入片段（這些集落是白色的）。

圖 7.示意圖顯示了在藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)中如何區(qū)分具有帶插入基因的質(zhì)粒的菌落和不具有插入基因的菌落。

雖然這是在基因構(gòu)建體克隆過(guò)程中使用藍(lán)白斑篩選的常見(jiàn)方法，但還有另一種藍(lán)白斑篩選方法。

這里，藍(lán)色菌落代表具有必要構(gòu)建體的菌落，白色菌落不具有該構(gòu)建體。

這是當(dāng)遺傳構(gòu)建體被克隆到宿主菌株的基因組中而不是我們上面討論的方式的克隆載體中時(shí)。

查看圖 8 中繪制的結(jié)構(gòu)。

圖8.克隆到宿主菌株基因組中的基于LacZ的轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因構(gòu)建體。

該構(gòu)建體描述了測(cè)量啟動(dòng)子 P轉(zhuǎn)錄效率的報(bào)告基因。該啟動(dòng)子越強(qiáng)， lacZ轉(zhuǎn)錄的水平就越高，最終細(xì)胞合成的 β-半乳糖苷酶的水平就越高。

因此，β-半乳糖苷酶活性可用作測(cè)量該啟動(dòng)子強(qiáng)度的讀數(shù)。

這些類(lèi)型的報(bào)告基因廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)。

在此類(lèi)構(gòu)建體的基因工程過(guò)程中采用藍(lán)白斑篩選。 X-gal 平板上顯示為藍(lán)色的菌落的基因組中含有該構(gòu)建體。它們就是我們想要的殖民地。白色菌落的基因組中沒(méi)有該構(gòu)建體；他們是不受歡迎的殖民地。

一旦制備出所需菌株并使用差異培養(yǎng)基通過(guò)藍(lán)白斑篩選進(jìn)行篩選，下一步將測(cè)試啟動(dòng)子強(qiáng)度。

為此，測(cè)試菌株和對(duì)照菌株在液體培養(yǎng)物中培養(yǎng)至相等的細(xì)胞密度，然后使用米勒測(cè)定法測(cè)量β-半乳糖苷酶活性。

該測(cè)定的結(jié)果用作測(cè)量 lacZ 融合的啟動(dòng)子強(qiáng)度的讀數(shù)（如上圖 8 所示）。通過(guò)觀察更多相應(yīng)的β-半乳糖苷酶活性來(lái)指示啟動(dòng)子強(qiáng)度越高。

這里需要注意的是，差異培養(yǎng)基和藍(lán)白斑篩選用于篩選具有必要遺傳構(gòu)建體的菌落，但在實(shí)際酶測(cè)定中則不然，在實(shí)際酶測(cè)定中，實(shí)驗(yàn)者使用不同的 β-半乳糖苷酶底物 - 例如 ONPG(2 -硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷）。

紅白篩選培養(yǎng)基

紅白斑篩選在理論上和技術(shù)上與藍(lán)白斑篩選相同。

然而，β-半乳糖苷酶的底物化合物不是 X-gal，而是添加到培養(yǎng)基中的品紅色-gal。品紅半乳糖被β-半乳糖苷酶分解后形成的產(chǎn)物呈紅色。

因此，根據(jù)菌落是否產(chǎn)生功能性 β-半乳糖苷酶，它們會(huì)是紅色或白色。

與藍(lán)白斑篩選非常相似，紅白斑篩選用于基因克隆過(guò)程中，以檢查哪些集落克隆了必要的基因構(gòu)建體。