弱染色或無(wú)染色

抗體濃度過(guò)低

• 嘗試增加一抗?jié)舛?/span>

• 考慮使用使用生物素化二抗的擴(kuò)增系統(tǒng)

抗體不相容性

• 確保二抗與一抗的物種和抗體亞類(lèi)兼容

高背景會(huì)模糊信號(hào)

• 請(qǐng)嘗試遵循下面本故障排除指南的“高背景或非特異性染色"部分中詳細(xì)介紹的建議。

膜被透化試劑損壞

• 嘗試使用較低濃度的清潔劑。

• 嘗試使用較弱的清潔劑（例如用 Triton X-100 代替 Tween-20）

抗體不適合 IHC

• 有些抗體不適合 IHC 中抗原的呈現(xiàn)方式。檢查數(shù)據(jù)表，了解之前是否已在 IHC 或 ICC 中進(jìn)行過(guò)測(cè)試，如果沒(méi)有，請(qǐng)考慮使用不同的抗體。

• 嘗試使用不同的固定方法，該方法將以不同的方式呈現(xiàn)抗原，因此可能允許抗體結(jié)合。

目標(biāo)蛋白豐度低

• 嘗試增加一抗?jié)舛?/span>

• 嘗試使用放大方法，例如生物素化二抗

固定可能會(huì)掩蓋目標(biāo)表位

• 嘗試第 5.2 節(jié)中描述的抗原修復(fù)方法之一

抗體對(duì)組織切片的滲透性較差

• 嘗試將抗體孵育更長(zhǎng)時(shí)間或以更高的濃度

• 嘗試使用更薄的組織切片

• 嘗試使用較小的一抗（例如使用 IgG 而不是 IgM）

通透性不足

• 嘗試增加緩沖液中 Triton-X100 的濃度。

• 如果使用 Tween-20，請(qǐng)考慮改用 Triton-X100，這是一種更強(qiáng)的清潔劑。

與檢測(cè)系統(tǒng)使用不兼容的二級(jí)熒光團(tuán)

• 仔細(xì)檢查所使用的顯微鏡系統(tǒng)是否具有適合所使用熒光團(tuán)的正確激發(fā)和發(fā)射濾光片。

• 考慮使用不同的熒光團(tuán)偶聯(lián)二抗。幾乎所有熒光顯微鏡至少都配備濾光片組，能夠?qū)?DAPI 和 FITC / Alexa Fluor 488 / Dylight 488 進(jìn)行成像。

安裝后熒光團(tuán)降解

• 免疫熒光切片封片后 2 天內(nèi)對(duì)切片進(jìn)行成像。

緩沖區(qū)退化

• 使用前檢查緩沖液的 pH 值

• 警惕細(xì)菌生長(zhǎng)的跡象，一旦發(fā)現(xiàn)就扔掉。

• 必要時(shí)新鮮制作。

降解的一抗

• 確?？贵w在制造商提供的最佳使用日期內(nèi)。

• 考慮將來(lái)分裝抗體，快速冷凍，然后儲(chǔ)存在 -80°C 下，以避免抗體降解的風(fēng)險(xiǎn)。

由于光漂白而損壞熒光團(tuán)共軛二抗

• 確保使用熒光團(tuán)共軛二抗時(shí)執(zhí)行的所有步驟都是在弱光或黑暗中進(jìn)行

• 成像時(shí)盡量使用盡可能低的照明來(lái)捕獲最佳圖像。這對(duì)于共焦顯微鏡尤其重要，因?yàn)楦呒す夤β试O(shè)置可以極快地漂白一些熒光團(tuán)。

• 考慮使用比 FITC 或 TRITC 等舊化合物更耐漂白的熒光團(tuán)。

不兼容的緩沖區(qū)

• 一些抗體在基于 TBS 的緩沖液中表現(xiàn)更好，而其他抗體則更喜歡 PBS。嘗試更換緩沖液，看看這是否會(huì)增加染色。 

過(guò)度固視

• 嘗試減少組織與固定劑一起孵育的時(shí)間。

• 考慮嘗試替代固定液

多路復(fù)用時(shí)在通道之間滲透

重疊的熒光團(tuán)激發(fā)/發(fā)射光譜

• 嘗試使用重疊有限的熒光團(tuán)對(duì)（例如DAPI、Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594）

• 使用光譜分析工具（例如FPbase Spectraviewer）確保熒光團(tuán)對(duì)之間的重疊有限。

• 嘗試使用單一抗體對(duì)照，看看一個(gè)通道中的信號(hào)是真實(shí)的還是只是由于滲漏所致。

• 一些先進(jìn)的圖像分析軟件具有可以（在一定程度上）校正滲色的功能。

成像系統(tǒng)上的激發(fā)和發(fā)射濾光片不合適

• 檢查熒光團(tuán)和濾光片之間的兼容性，以確保每個(gè)濾光片僅捕獲熒光團(tuán)。

• 對(duì)于共焦顯微鏡，請(qǐng)考慮收緊允許進(jìn)入檢測(cè)器的光波長(zhǎng)窗口并使用測(cè)序，以便每個(gè)熒光團(tuán)只有一個(gè)激光處于活動(dòng)狀態(tài)。

組織形態(tài)改變

冰傷害

• 確保在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中按照既定方案（例如本文件中列出的方案）冷凍組織。將組織切片放入 30% 蔗糖中時(shí)，確保組織已全沉沒(méi)，否則蔗糖可能沒(méi)有足夠的時(shí)間擴(kuò)散到組織中。

• 考慮在分析中引入損傷評(píng)分系統(tǒng)，以評(píng)估冰損傷是否影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 

自由浮動(dòng)部分的粗暴處理

• 使用網(wǎng)等設(shè)備可以幫助減少整個(gè)協(xié)議中組織切片所需的處理量。

• 使用優(yōu)質(zhì)細(xì)畫(huà)筆拾取和移動(dòng)部分。確保沒(méi)有被低溫恒溫器/切片機(jī)刀片降解。

• 安裝自由浮動(dòng)部分時(shí)，盡量避免接觸部分，而是使用刷子飄到載玻片上。

因儲(chǔ)存不當(dāng)而降解

• 如果保存不當(dāng)，切片可能會(huì)被微生物生長(zhǎng)污染?？紤]使用 0.05% 疊氮hua鈉來(lái)防止儲(chǔ)存溶液或冷凍切片中的生長(zhǎng)

抗原修復(fù)過(guò)于苛刻

• 考慮將抗原修復(fù)方法改為不太苛刻的方法

冰凍切片從載玻片上脫落

• 確保始終對(duì)載玻片進(jìn)行處理，以確保切片更有效地粘貼。雖然有商業(yè)品種，但可以按照CSH 協(xié)議等既定協(xié)議在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)載玻片進(jìn)行替換； 

固定不佳

• 不全固定會(huì)導(dǎo)致組織迅速降解。嘗試增加組織與固定劑一起孵育的時(shí)間或考慮增加固定劑的濃度。

高背景或非特異性染色

組織切片中的自熒光分子

• 如果組織尚未灌注，請(qǐng)考慮在下一個(gè)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，因?yàn)槭Ｓ嗟募t細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的自發(fā)熒光。

• 自發(fā)熒光可能是由固定劑引起的。嘗試使用不同的固定劑。

• 確保 NaBH 4是新鮮制備的

• 嘗試用淬滅熒光的染料（例如，Pontamine 天藍(lán)、蘇丹黑或臺(tái)盼藍(lán)）孵育切片。

• 嘗試使用與自發(fā)熒光波長(zhǎng)不同的熒光團(tuán)（例如紅移染料，如 Alexa Fluor 680） 

非特異性二次結(jié)合

• 運(yùn)行無(wú)初級(jí)對(duì)照以評(píng)估次級(jí)對(duì)照是否與組織切片結(jié)合。

• 如果一抗與組織來(lái)自同一物種，這可能會(huì)導(dǎo)致重大問(wèn)題。請(qǐng)參閱本協(xié)議或考慮使用不同種類(lèi)的一抗。 

一抗?jié)舛冗^(guò)高

• 嘗試降低一抗?jié)舛?/span>

二抗?jié)舛冗^(guò)高

• 嘗試降低二抗的濃度。我們發(fā)現(xiàn) 1:300 至 1:500 的稀釋度是一個(gè)不錯(cuò)的起點(diǎn)。

抗體純化不充分

• 未純化的多克隆抗體可能含有與一系列非靶蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體。檢查數(shù)據(jù)表；理想情況下，應(yīng)使用免疫原作為誘餌，通過(guò)親和層析純化多克隆抗體。 

• 雖然單克隆抗體的問(wèn)題較少見(jiàn)，但仍應(yīng)至少使用 Protein A 或 G 親和層析進(jìn)行純化。

• 如果有其他替代品，請(qǐng)考慮改用更好的純化抗體，或者如果沒(méi)有其他替代品，請(qǐng)考慮內(nèi)部純化抗體。  

阻擋不足

• 確保封閉血清與培養(yǎng)二抗的物種相同。

• 嘗試使用不同的阻塞解決方案。

• 嘗試增加封閉步驟的長(zhǎng)度或增加血清濃度

洗滌不足

• 嘗試增加洗滌的時(shí)間和/或次數(shù)。

• 確保洗滌期間有足夠的攪拌，以幫助未結(jié)合的抗體擴(kuò)散出組織

一抗與組織切片來(lái)自同一物種。

• 運(yùn)行無(wú)初級(jí)對(duì)照以評(píng)估次級(jí)對(duì)照是否與組織切片結(jié)合。

• 如果一抗與組織來(lái)自同一物種，這可能會(huì)導(dǎo)致重大問(wèn)題。請(qǐng)參閱本協(xié)議第 4.3 節(jié)或考慮使用不同種類(lèi)的一抗。

內(nèi)源酶活性（用于顯色檢測(cè)）

• 嘗試用特定抑制劑阻斷內(nèi)源酶活性。

對(duì)于 HRP 結(jié)合二抗，使用 0.3% H 2 O 2 10-15 分鐘。如果在此濃度下封閉不成功，請(qǐng)考慮增加至 3%。 

對(duì)于 AP 結(jié)合二抗，請(qǐng)使用 2mM 左旋咪唑。 

部分已經(jīng)干了

• 確保切片始終保持濕潤(rùn)，并在加濕室中使用載玻片安裝方案進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間孵育。

底物過(guò)多（用于顯色檢測(cè)）

• 嘗試降低底物濃度或孵育時(shí)間。

信號(hào)放大率過(guò)高（如果使用生物素化二抗）

• 嘗試降低擴(kuò)增試劑或二抗的濃度。

• 考慮信號(hào)放大是否必要或者標(biāo)準(zhǔn)方法是否有效。

組織切片厚度

• 組織切片越厚，寬視野顯微鏡中的散射光越多。嘗試使用更薄的開(kāi)關(guān)部分或共焦顯微鏡。