Aobious 免疫測定試劑盒

1-磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸磷酸二酯酶ELISA試劑盒

1-磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸磷酸二酯酶ELISA試劑盒
目錄號:E0269h

范圍:0.156-10納克/毫升

預(yù)期用途

該免疫測定試劑盒允許體外定量測定人1-磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸磷酸磷酸二酯酶γ-1、血清、血漿、尿液、組織勻漿和細胞培養(yǎng)上清液以及其他生物流體中的濃度。


測試原理

該試劑盒中提供的微量滴定板已經(jīng)預(yù)先包被了特異性針對1-磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸磷酸二酯酶γ-1的抗體。然后將標(biāo)準(zhǔn)品或樣品加入適當(dāng)?shù)奈⒘康味ò蹇字?，將?-磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸磷酸二酯酶γ-1特異的生物素偶聯(lián)的多克隆抗體制劑和與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的抗生物素蛋白加入每個微量滴定板孔中并孵育。然后向每個孔中加入TMB底物溶液。只有那些含有1-磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸磷酸二酯酶γ-1、生物素偶聯(lián)的抗體和酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白的孔會顯示顏色變化。通過加入硫酸溶液終止酶-底物反應(yīng)，并用分光光度計在450nm±2nm的波長下測量顏色變化。然后通過將樣品的外徑與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較來確定樣品中的濃度。

材料和部件

試劑數(shù)量

檢測板1

標(biāo)準(zhǔn)2

樣本稀釋液1×20毫升

檢測稀釋劑A 1×10毫升

檢測稀釋劑B 1×10毫升

檢測試劑A 1 × 120μl

檢測試劑B 1 × 120μl

洗滌緩沖液(25倍濃縮液)1×30毫升

底物1×10毫升

停止溶液1×10毫升

用于96孔的平板密封器5

說明1


所需的其他用品

酶標(biāo)儀

移液器和移液器吸頭

EP管

去離子水或蒸餾水


工具包的儲存

檢測板、標(biāo)準(zhǔn)品、檢測試劑A和檢測試劑B收到后應(yīng)儲存在-20℃下。收到試劑盒后，底物應(yīng)始終保存在4℃下。其他試劑根據(jù)小瓶上的標(biāo)簽保存。但是為了長期保存，請將整個試劑盒保存在-20℃下。未使用的條帶應(yīng)保存在密封袋中，并提供干燥劑，以盡量減少暴露在潮濕空氣中。檢測試劑盒可在試劑盒的有效期內(nèi)使用(自生產(chǎn)日期起六個月)。如果按照上述規(guī)定儲存，打開的檢測試劑盒將保持穩(wěn)定，直到所示的失效日期。


樣本收集和儲存

血清-使用血清分離管(SST ),使樣品凝結(jié)30分鐘，然后以大約1000 × g的速度離心15分鐘。取出血清并立即進行分析，或者等分并在-20℃或-80℃下儲存樣品。

血漿-使用EDTA或肝素作為抗凝劑收集血漿。在采集的30分鐘內(nèi)，將樣品在2℃ - 8℃下以1000 × g離心15分鐘。將樣品儲存在-20℃或-80℃下。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

尿液——無菌收集當(dāng)天的第一次尿液(中段),直接排入無菌容器。離心去除顆粒物質(zhì)，立即化驗或等分并儲存在≤ -20℃下。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

組織勻漿——組織勻漿的制備取決于組織類型。對于該分析，用1X PBS沖洗組織以去除多余的血液，在20mL 1X PBS中勻漿，并在≤ -20℃下儲存過夜。在進行兩次凍融循環(huán)以破壞細胞膜后，將勻漿以5000 x g離心5分鐘。去除上清液并立即進行分析，或者等分并在≤ -20℃下儲存。

細胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體——通過離心去除顆粒，并立即進行分析，或在-20℃或-80℃下等分并儲存樣品。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

注意:

5天內(nèi)使用的樣品可儲存在2-8℃下，否則樣品必須儲存在-20℃ (1個月)或-80℃ (2個月)，以避免生物活性損失和污染。
由于某些化學(xué)物質(zhì)的影響，由化學(xué)裂解緩沖液制備的組織或細胞提取樣本可能會導(dǎo)致意外的ELISA結(jié)果。
受包括細胞生存力、細胞數(shù)量以及取樣時間等因素的影響，試劑盒可能無法檢測到來自細胞培養(yǎng)上清液的樣品
樣本溶血會影響結(jié)果，因此不能檢測溶血標(biāo)本。
進行檢測時，將樣品緩慢置于室溫。
不要使用熱處理過的樣品。

程序的局限性

AOBIOUS僅對試劑盒本身負(fù)責(zé)，但不對檢測過程中消耗的樣品負(fù)責(zé)。用戶應(yīng)計算整個測試中可能使用的樣本量。請?zhí)崆邦A(yù)留足夠的樣品。
試劑盒不得在超過試劑盒標(biāo)簽上的有效期后使用。
請勿將其他批次或來源的試劑混合或替換。
如果樣本生成的值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，用樣本稀釋劑進一步稀釋樣本，然后重復(fù)檢測。標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑、操作員、移液技術(shù)、清洗技術(shù)、培養(yǎng)時間或溫度以及試劑盒年限的任何變化都會導(dǎo)致結(jié)合的變化。

試劑制備

洗滌緩沖液-如果濃縮物中有晶體形成，加熱至室溫并輕輕混合，直到晶體溶解。將30毫升洗滌緩沖液濃縮物稀釋到去離子或蒸餾水中，以制備750毫升洗滌緩沖液。
標(biāo)準(zhǔn)品-用1.0毫升樣品稀釋液重新配制標(biāo)準(zhǔn)品。這種復(fù)溶產(chǎn)生200 ng/mL的儲備溶液。在進行系列稀釋之前，讓標(biāo)準(zhǔn)品靜置至少15分鐘，并輕輕攪動(不允許直接在孔中進行系列稀釋)。未稀釋的標(biāo)準(zhǔn)作為高標(biāo)準(zhǔn)(200 ng/mL)。樣本稀釋劑用作零標(biāo)準(zhǔn)(0 ng/mL)。

納克/毫升200±100。50.0 25.0 12.5 6.25 3.12 0

檢測試劑A和B -分別使用檢測稀釋劑A和B (1:100)稀釋至工作濃度。

化驗程序

讓所有試劑達到室溫(請勿直接在37℃溶解試劑)。移液前，應(yīng)輕輕旋轉(zhuǎn)，混合所有試劑。避免起泡。為一次實驗保留適當(dāng)數(shù)量的試紙條，并從微量滴定板上移除多余的試紙條。取出的試紙條應(yīng)重新密封，并儲存在4℃下，直至試劑盒到期。按照前面章節(jié)的說明準(zhǔn)備所有試劑、工作標(biāo)準(zhǔn)和樣品。請在化驗前預(yù)測濃度。如果這些值不在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，用戶必須為他們的特定實驗確定最佳樣品稀釋度。


每孔添加100 μl標(biāo)準(zhǔn)品、空白或樣品。用板密封器覆蓋。在37℃下孵育2小時。
清除每個孔的液體，不要沖洗。向每個孔中添加100 μl檢測試劑工作溶液。用板密封器覆蓋。在37℃下孵育1小時。檢測試劑A工作溶液可能會出現(xiàn)渾濁。升溫至室溫，輕輕混合，直到溶液變得均勻。
吸取每個孔并清洗，重復(fù)該過程三次，總共清洗三次。使用噴射瓶、多通道移液器、歧管分配器或自動清洗器，用清洗緩沖液(約400 μl)填充每個孔進行清洗。在每個步驟中去除液體對于良好的性能至關(guān)重要。最后一次清洗后，通過抽吸或傾析去除任何殘留的清洗緩沖液。將盤子倒置，用干凈的紙巾吸干。
向每個孔中加入100 μl檢測試劑B工作溶液。用新的板密封劑覆蓋。在37℃下孵育1小時。
重復(fù)步驟4中的抽吸/清洗。
向每個孔中加入90 μl底物溶液。用新的板密封劑覆蓋。在37℃下孵育15-30分鐘。避光。
向每個孔中加入50 μl終止液。如果顏色變化不均勻，輕敲平板以確保充分混合。
使用設(shè)置為450納米的酶標(biāo)儀，一次測定每個孔的光密度。

注意:

吸光度是孵育時間的函數(shù)。因此，在開始分析前，建議所有試劑在使用前應(yīng)新鮮制備，并且所有需要的條形孔都固定在微量滴定框架中。這將確保每個移液步驟花費的時間相等，不會中斷。
請根據(jù)說明小心地重新配制標(biāo)準(zhǔn)品或工作檢測試劑A和B，避免起泡并輕輕混合，直到晶體溶解。復(fù)溶的標(biāo)準(zhǔn)檢測試劑A和B只能使用一次。這種分析需要少量的移液。為了最大限度地降低移液造成的不精確性，請確保移液器經(jīng)過校準(zhǔn)。建議一次移液吸取10μl以上。
為了確保準(zhǔn)確的結(jié)果，在培養(yǎng)步驟中，板密封器的適當(dāng)粘附是必要的。在孵育步驟之間，不要讓孔長時間無蓋放置。一旦將試劑添加到孔板條中，在檢測過程中的任何時候都不要讓孔板條變干。
對于程序中的每個步驟，向檢測板添加試劑的總分配時間不應(yīng)超過10分鐘。
為避免交叉污染，請在添加每個標(biāo)準(zhǔn)水平、添加樣品和添加試劑之間更換移液器吸頭。此外，每種試劑使用單獨的容器。
清洗程序至關(guān)重要。清洗不充分會導(dǎo)致精度下降和吸光度讀數(shù)錯誤升高。
盡管不要求，但建議復(fù)制所有標(biāo)準(zhǔn)和樣本。
底物溶液容易被污染。請避光保存。


特征：該分析識別重組和天然人1-磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸磷酸二酯酶γ-1。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)或干擾。

注意:限于目前的技術(shù)和知識，我們不可能完成人與所有類似物之間的交叉反應(yīng)檢測，因此，交叉反應(yīng)可能仍然存在。

探測距離：3.12-200納克/毫升。

統(tǒng)計

平均每個標(biāo)準(zhǔn)品、對照品和樣品的重復(fù)讀數(shù)，并減去平均零標(biāo)準(zhǔn)光密度。使用能夠生成四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合的計算機軟件，通過減少數(shù)據(jù)來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線?；蛘?，通過在x軸上繪制每個標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度與y軸上的濃度來構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過圖上的點繪制最佳擬合曲線。數(shù)據(jù)可以通過繪制1-磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸磷酸二酯酶γ-1濃度的對數(shù)對O.D .的對數(shù)來線性化，并且最佳擬合線可以通過回歸分析來確定。建議用一些相關(guān)的軟件來做這個計算，比如曲線專家1.3。這個過程將產(chǎn)生一個適當(dāng)?shù)牡惶_的數(shù)據(jù)擬合。如果樣品已經(jīng)稀釋，從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取的濃度必須乘以稀釋系數(shù)。

重要提示:

受目前條件和科學(xué)技術(shù)的限制，我們無法對供應(yīng)商提供的原材料進行全面的鑒定和分析。因此，使用該試劑盒可能存在一些定性和技術(shù)風(fēng)險
最終的實驗結(jié)果將與產(chǎn)品的有效性、最終用戶的操作技能和實驗環(huán)境密切相關(guān)。請確保有足夠的樣品。
不同批次的試劑盒在檢測范圍、靈敏度和顯色時間上可能略有不同。請嚴(yán)格按照試劑盒中的說明進行實驗，而我們網(wǎng)站上的電子說明僅供參考。
第一次打開板時，孔中可能有一些模糊的物質(zhì)。它不會對最終檢測結(jié)果產(chǎn)生任何影響。
除非需要，否則不要從儲存袋中取出微量滴定板。
帶寬為10納米或更小、在450納米波長下光密度范圍為0-3 OD或更大的微量滴定板讀數(shù)器可用于吸光度測量。
每次轉(zhuǎn)移時使用新的一次性移液器吸頭，以避免污染。
請勿將試劑從一個試劑盒批次替換到另一個試劑盒批次。僅使用制造商提供的試劑。
即使是同一個操作員在兩個不同的實驗中也可能得到不同的結(jié)果。為了獲得更好的重現(xiàn)性結(jié)果，應(yīng)控制檢測中每一步的操作。此外，建議在對每批產(chǎn)品進行檢測前進行初步實驗。
每個套件都經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制測試。然而，由于一些意外的運輸條件或不同的實驗室設(shè)備，最終用戶的結(jié)果可能與我們的內(nèi)部數(shù)據(jù)不一致。來自不同批次的試劑盒之間的測定內(nèi)差異也可能由上述因素引起。
不同制造商生產(chǎn)的同一產(chǎn)品的試劑盒可能會產(chǎn)生不同的結(jié)果，因為我們沒有將我們的產(chǎn)品與其他制造商的產(chǎn)品進行比較。
有效期:六個月。

預(yù)防

建議與該試劑盒一起使用的終止溶液是酸性溶液。使用這種材料時，戴上眼睛、手、臉和衣服防護裝置。

典型數(shù)據(jù)

此圖表數(shù)據(jù)作為示例顯示。每次運行檢測時，必須生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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