品牌 其他品牌 貨號 APP-101-FAMX 供貨周期 現(xiàn)貨 應(yīng)用領(lǐng)域 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥/生物制藥
jenabioscience:高保真熒光素PCR標(biāo)記試劑盒 ——PCR法制備熒光素標(biāo)記的DNA探針Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一組科學(xué)家于1998年成立，利用超過25年的學(xué)術(shù)知識為100多個國家的研究和行業(yè)客戶開發(fā)創(chuàng)新試劑。
供一般實(shí)驗(yàn)室使用。
運(yùn)輸: 凝膠包裝運(yùn)輸
儲存條件: 儲存在-20°C 避免冷凍/解凍循環(huán)，避光儲存
保質(zhì)期: 12個月
光譜特性: λ exc 492納米，λ 全身長的 517納米，ε 83.0毫摩爾 -1 厘米 -1 (三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH 7.5)
描述: 高保真熒光素PCR標(biāo)記試劑盒設(shè)計(jì)用于通過PCR隨機(jī)產(chǎn)生熒光素修飾的DNA探針。這種探針非常適合熒光 原地的 雜交(FISH)和Northern印跡實(shí)驗(yàn)。如果模板量有限或需要擴(kuò)增特定的DNA片段，基于PCR的標(biāo)記優(yōu)于用Klenow片段的隨機(jī)引物標(biāo)記。高達(dá)4kb的探針擴(kuò)增是可行的。
使用優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液和高保真聚合酶混合物，熒光素-12-dUTP作為其天然對應(yīng)物dTTP的替代物被有效地?fù)饺氲紻NA中，所述高保真聚合酶混合物包括 Taq 聚合酶和校對酶。50 %熒光素-12-dUTP取代通常導(dǎo)致反應(yīng)和標(biāo)記效率之間的最佳平衡。然而，熒光素-12-dUTP/dTTP比率的個體優(yōu)化可以容易地用單核苷酸形式實(shí)現(xiàn)。 該試劑盒包含足夠的試劑，可用于10次標(biāo)記反應(yīng)(S-Pack)或50次標(biāo)記反應(yīng)(L-Pack)，每次20μL(50%熒光素-12-dUTP替代，100微米dATP/dGTP/dCTP，50微米dTTP，50微米熒光素-12-dUTP)。
內(nèi)容: 在含有50%甘油(v/v)的儲存緩沖液中 # APP-101-FAMX-S:1個40微升(100個單位，2.5個單位/微升) # APP-101-FAMX-L:2個40微升(2個100單位，2.5單位/微升)
高保真標(biāo)記緩沖液 1個500微升(10倍)
dATP溶液 1個20微升(100毫米)
dGTP解決方案 1個20微升(100毫米)
dCTP溶液 1個20微升(100毫米)
dTTP溶液 1個20微升(100毫米)
熒光素-12-dUTP # APP-101-FAMX-S:1個10微升(1毫米) # APP-101-FAMX-L:5個10微升(1毫米)
DNA 1個20微升(100納克/微升)
500 bp正向引物 1個20微升(10微米)
500 bp反向引物 1個20微升(10微米)
PCR級水 1x 1.2毫升
由用戶提供 DNA模板 底漆 DNA純化工具(可選)
1.工作溶液的制備
1.1 1mM dATP/dCTP/dGTP工作溶液的制備
將100 mM dATP、100 mM dCTP和100 mM dGTP溶液在冰上、voretex上解凍，并短暫旋轉(zhuǎn)。 用PCR級水制備1:100的稀釋液，以達(dá)到1 mM的最終濃度(例如2μl 100mM dATP+2μl 100mM dCTP+2μl 100mM dGTP+194μl PCR級水)。 1 mM ATP/CTP/GTP工作溶液可儲存在-20°c下。準(zhǔn)備等分試樣以避免冷凍/解凍循環(huán)。 1.2 1mM dTTP工作溶液的制備
在冰上融化100 mM dTTP溶液，voretex并短暫旋轉(zhuǎn)。 用PCR級水制備1:100的稀釋液，以達(dá)到1 mM的最終濃度(例如2 μl 100 mM dTTP + 198 μl PCR級水)。 1 mM dTTP工作液可儲存在-20°c下。準(zhǔn)備等分試樣以避免冷凍/解凍循環(huán)。 3.標(biāo)準(zhǔn)PCR標(biāo)記方案
標(biāo)準(zhǔn)方案用于標(biāo)記500 bp的DNA片段。反應(yīng)和標(biāo)記效率之間的最佳平衡通常是按照下面的標(biāo)準(zhǔn)方案用50%熒光素-12-dUTP取代來實(shí)現(xiàn)的，然而，個體優(yōu)化可能改善個體應(yīng)用的結(jié)果。
按照下列順序在冰上組裝PCR(無脫氧核糖核酸酶反應(yīng)管)。 Voretex和簡單的降速。 在弱光條件下進(jìn)行檢測設(shè)置和反應(yīng)。
成分 卷 最終概念 PCR級水 X μl 高保真標(biāo)記緩沖液(10x) 2微升 1x 1 mM dATP/dCTP/ dGTP工作溶液(s. 1.1) 2微升 100微米 1 mM dTTP工作溶液(s. 1.2) 1微升 50微米 1 mM熒光素-12-dUTP 1微升 50微米 正向引物 (10微米) X μl 0.1 - 1微米(例如0.3微米500 bp正向引物) 反向引物 (10微米) X μl 0.1 - 1微米(例如0.3微米500 bp反向引物) 模板dna X μl 1 - 10 ng基因組DNA(例如1 ngλDNA) 高保真聚合酶(2.5單位/微升) 1微升 2.5單位 總體積 20微升
推薦的騎行條件
循環(huán)步驟 溫度 時間 周期 最初的 變性 95攝氏度 2分鐘 1x 變性 熱處理 1) 延長 2) 95攝氏度 58攝氏度 68攝氏度 20秒 30秒 60秒 30x 最后的 延長 68攝氏度 2分鐘 1x
1) 退火溫度取決于所用引物的熔化溫度。 2) 延伸時間取決于待擴(kuò)增片段的長度。建議時間為2分鐘/kbp。72°C時的伸長率也同樣有效。
為了獲得最佳擴(kuò)增結(jié)果和高摻入率，對于每個新的引物-模板對，可能需要對推薦的PCR檢測和循環(huán)條件進(jìn)行單獨(dú)優(yōu)化。
4.探針純化:
大多數(shù)雜交實(shí)驗(yàn)不需要探針純化。如果下游應(yīng)用需要純化(例如通過吸光度測量進(jìn)行濃度測定)，我們建議采用基于硅膠膜或凝膠過濾的純化方法。
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上海牧榮生物科技有限公司
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