trialtusbioscience：CRISPR-Cas9 Protein  貨號(hào)：40-1320/40-1325

TriAltus Bioscience誕生于伯明翰阿拉巴馬大學(xué)的創(chuàng)新研究，是一家致力于將開(kāi)創(chuàng)性的clm(CL7/Im7)純化技術(shù)商業(yè)化的衍生公司。Dmitry Vassylyev博士及其團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的這一專(zhuān)有系統(tǒng)重新定義了行業(yè)中酶純度和活性的標(biāo)準(zhǔn)。

TriAltus的高純度Cas9蛋白用于CRISPR技術(shù)的基因組編輯。重組化膿性鏈球菌Cas9 (wt)蛋白在大腸桿菌具有兩個(gè)(N-末端和C-末端)核定位信號(hào)(NLS)和CL7標(biāo)簽，其在純化過(guò)程中用切割前蛋白酶除去。Cas9蛋白與指導(dǎo)RNA (gRNA)結(jié)合，形成穩(wěn)定的核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物，使細(xì)胞中的基因組編輯高效而精確。

規(guī)范

純潔| ~99% (SDS-PAGE凝膠分析)

酶源|化膿性鏈球菌Cas9表達(dá)于大腸桿菌用兩個(gè)(N-末端和C-末端)核定位信號(hào)(NLS)，并用我們的CL7標(biāo)簽技術(shù)純化。

內(nèi)毒素|<0.3 EU/ug by rFC method

儲(chǔ)存；儲(chǔ)備/運(yùn)輸專(zhuān)注度|5毫克/毫升

存儲(chǔ)緩沖|10 mM Tris-Cl pH 8.0，250 mM NaCl，50%甘油

推薦的儲(chǔ)存條件|-80攝氏度

過(guò)期|按照指示儲(chǔ)存時(shí)，自收到之日起6個(gè)月。避免重復(fù)冷凍/解凍循環(huán)。

圖一。與商業(yè)獲得的Cas9相比，CL7/Im7純化的Cas9的切割活性。在1.2%瓊脂糖/TAE凝膠上解析反應(yīng)，然后用SYBR GOLD染色。從商業(yè)來(lái)源(CO)獲得的Cas9或CL7/Im7純化的Cas9 (Im7)與等摩爾(+)，或無(wú)(-)，退火的sgRNA復(fù)合。將不同濃度的復(fù)合物與1.1 kb的目標(biāo)DNA片段在37℃下孵育15分鐘。sgRNA識(shí)別目標(biāo)DNA中間的序列，切割后產(chǎn)生約550 bp的片段。Im7純化的Cas9顯示出與商業(yè)Cas9相當(dāng)?shù)幕钚浴?/span>

圖二。CL7/Im7純化的Cas9和4步純化的Cas9在細(xì)胞中的活性相同。

(一)在用Lonza nucleofector 2b電穿孔和使用來(lái)自4步純化(頂行)或1步純化方案(底行)的Cas9WT改變RNP濃度后，人鐮狀細(xì)胞iPSCs(誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)的相差顯微鏡檢查。

(二)中所示的電穿孔實(shí)驗(yàn)的存活率和修飾表(一)。用兩種方案純化的Cas9制備的RNP用一種sgRNA進(jìn)行測(cè)試，該sgRNA被設(shè)計(jì)用來(lái)糾正導(dǎo)致鐮狀細(xì)胞病的血紅蛋白中的1 BP錯(cuò)誤。通過(guò)數(shù)字PCR評(píng)估修飾率。這些蛋白質(zhì)產(chǎn)生了相同的生存力和修飾率，表明在細(xì)胞中具有同等的效率。這些測(cè)試是由UAB阿拉巴馬大學(xué)的蒂姆·湯斯和丁磊完成的。

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